|
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. Метод микробиологического измерения 1.
Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток
штамма Penicillium canescens F-832
ВКПМ продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне
концентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м3 воздуха. Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТ
17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам
определения загрязняющих веществ». Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в
установленном порядке на право проведения микробиологических исследований. 2.
Характеристика штамма-продуцента ксиланазы
Микроорганизм Penicillium
canescens F-832 является продуцентом фермента ксиланазы. Культура образует
цепочки спор обычно прямые с гладкой оболочкой. Штамм растет на различных
агаризованных и жидких средах. На сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре
30 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым или
сероватым налетом, диаметром 2- 3 мм. На 4-5 сутки инкубации размеры колонии
достигают 5- 7 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется,
образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, подошва колоний
оранжево-коричневая. Штамм устойчив практически ко всем широко известным
антибиотикам. ПДК штамма в атмосферном воздухе 200 кл/м3,
пометка А. 3.
Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнения измерений количества
клеток продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне
концентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной
вероятности 0,95. 4.
Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток
продуцента ксиланазы на поверхность плотной питательной среды и подсчета
выросших колоний по типичным морфологическим признакам. Косвенный метод измерения концентрации
штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на
поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний
по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результат
продукции ксиланазы на среде с окрашенной целлюлозой. 5.
Средства измерений, вспомогательные устройства,
|
5.1.
Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
5.2
Реактивы, растворы
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
При выполнении измерений концентрации клеток
продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие
требования:
6.1. Правила техники безопасности при работе с
химическими реактивами по ГОСТ
12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с
электроустановками по ГОСТ
12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. «Инструкции по устройству, требованиям
безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях
предприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в
вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
К выполнению измерений и обработке их результатов
допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших
соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических
исследований.
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к
анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С),
атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента ксиланазы воздух,
аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность
плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5- 20 мин) зависит от
предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха
тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку
крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой,
одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки
прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска,
прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной
чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации
и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по
морфологическим признакам колоний, выросших на 3-5 сутки после посева воздуха.
Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют
свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из
антибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (для подавления посторонней
бактериальной микрофлоры) и нистатина (10 мкг/мл для подавления грибковой
флоры), тщательно перемешивают и разливают по 10-15 мл в стеклянные чашки Петри
на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на
сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные
чашки используют для контроля воздуха.
При выполнении анализа воздуха косвенным методом
селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л
бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно
перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной
поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания
целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в
термостат на 30 °С. Через 72 часа производят подсчет выросших типичных колоний
продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1
м' воздуха производят по формуле:
кл/м3 ,где
Х- концентрация клеток продуцента в воздухе,
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,
1 000 - коэффициент пересчета на 1 м3
воздуха,
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время
аспирации).
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа
Penicillium canescens F-832 ВКПМ продуцента ксиланазы
в атмосферном воздухе
1. Дата проведения анализа_______________
2. Место отбора пробы__________________
3.Название лаборатории_________________
4.Юридический адрес организации________
Результаты микробиологического анализа
Шифр или № пробы |
Определяемый микроорганизм |
Концентрация, кл/м3 |
|
|
|
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД
52.04.186-96- М., 1991. 693с.
2. ГОСТ 8.563-96.. ГСИ «Методики
выполнения измерений».
3. ГОСТ
17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам
определения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.
СОДЕРЖАНИЕ
|